一名 3 岁婴儿型 Krabbe 病患儿在接受 AAV 基因治疗后，于 L2–L3 椎旁出现 GLI1 改变的肿瘤。长读长测序显示，一个缺失 GALC 转基因和 poly(A) 信号的亚基因组载体片段整合进 GLI1 内含子 1，经剪接驱动 GLI1 全长表达。该案例提示载体纯度与盒式设计对长期安全性的意义。
病例背景：两次移植后的基因治疗
Krabbe 病是一种罕见的常染色体隐性遗传病。GALC 基因突变导致半乳糖脑苷脂酶缺乏，脂质 psychosine 蓄积，引发中枢和周围神经系统广泛脱髓鞘与神经退行。AAV 介导的基因治疗因此被视为有前景的治疗策略。
该患儿携带 GALC 双等位变异（p.Arg220Ter 与 p.Tyr319Cys）。他在 5 月龄和 9 月龄先后接受两次脐血移植，每次均经清髓性烷化剂预处理。
第二次移植后第 29 天，他接受了静脉 FBX-101 治疗，剂量为 3×10¹³ 载体基因组/公斤体重，属于 RESKUE 试验。FBX-101 是一种 AAVrh.10 衣壳载体，两侧为 AAV2 反向末端重复序列（ITR），携带 GALC，由 CAG 启动子调控——该启动子由巨细胞病毒增强子与鸡 β-肌动蛋白启动子组成。
治疗后患者免疫重建持续不佳，接受了供者淋巴细胞输注，并因移植物抗宿主病接受免疫抑制治疗。26 个月后，监测性 MRI 偶然发现 L2–L3 椎旁肿块。
肿瘤的分子特征：GLI1 被激活
活检显示为小圆蓝细胞肿瘤，呈局灶性上皮样、巢状外观。标本 CD56 和 S100 阳性，原位杂交显示 GLI1 强阳性，Ki-67 指数低于 10%。诊断指向 GLI1 改变的新生肿瘤。
GLI1 mRNA 水平在该机构泛癌队列 5143 份样本中位列第 100 百分位，同时伴 PTCH1 过表达。靶向测序显示基因组为稳定二倍体，未见致癌突变或融合。
这意味着，肿瘤并非由经典的点突变或基因融合驱动，而是另有机制。
长读长测序锁定整合事件
纳米孔长读长测序发现，GLI1 内含子 1 中存在一个克隆性 1038 bp 插入，见于 44% 的读段，两侧为 115 bp 的靶位点重复。
整合片段是一个亚基因组载体片段，包含部分 AAV2 ITR、巨细胞病毒增强子、鸡 β-肌动蛋白启动子、外显子 1，以及一个剪接供体；它缺失 GALC 转基因和 poly(A) 信号。
该剪接供体产生了嵌合转录本，将鸡 β-肌动蛋白外显子 1 连接到 GLI1，驱动 GLI1 全长表达。局限于整合等位基因的等位特异性低甲基化，进一步把整合确立为 GLI1 激活的直接原因。
作者指出，AAV 载体以非整合为主，在数千名受者中具有确立的安全性记录。但本案例与 Ahrens-Nicklas 等此前报道的病例相似：整合体均为截短、重排的亚基因组结构，保留了 CAG 启动子-增强子和剪接供体，激活了发育性转录因子。
工艺视角：杂质与盒式设计的双重警示
一个关键细节是：本例整合体不含转基因，也不含 poly(A) 序列。作者提出，制造过程中产生的"回折"或仅含启动子的载体物种，可能就是整合底物。
这指向两个工艺层面的问题。其一，载体纯度——包装过程中产生的截短、无转基因的亚基因组物种，可能成为潜在整合底物。其二，盒式设计——含剪接供体的元件一旦整合到宿主基因附近，可能产生嵌合转录本。
作者还讨论了本例移植背景的潜在贡献：DNA 毒性治疗与免疫抑制可能营造了有利于克隆扩增的环境。该整合事件已及时报告治疗医生和美国食品药品监督管理局。末次随访时，患者仍无症状。
对 AAV 工艺的启示
这封信的核心建议明确：需要无剪接供体的盒式设计，同时关注载体纯度，并在 AAV 基因治疗后进行延长的基因组监测。
对工艺开发而言，它把"载体纯度"从放行指标提升为安全性议题。亚基因组杂质、截短基因组、仅含启动子的物种——这些在常规质控中可能被容忍的组分，在整合致瘤的语境下获得了新的权重。
同时，盒式设计中看似无害的剪接供体元件，在整合事件中可能成为激活邻近原癌基因的开关。设计阶段的序列选择，与长期安全性直接相关。
一个值得持续追问的问题是：在非整合为主的 AAV 载体中，究竟哪一类亚基因组杂质、在何种剂量与宿主背景下，才具备整合并驱动克隆扩增的能力？这或许需要更系统的载体组分表征与长期随访数据来回答。
