抗体药物偶联物（ADC）概况：生产、作用机制（MOA）、FDA批准的抗体及功能检测

内容索引 抗体药物偶联物（ADC）产品介绍 案例研究：抗体药物偶联物（ADC）产品数据 GeneMedi的抗体药物偶联物（ADC）产品列表 什么是抗体药物偶联物（ADC）？—— 介绍 临床应用中的抗体药物偶联物（ADC）（已批准/BLA、I/II/III期） 抗体药物偶联物（ADC）的主要元素 1. 抗体药物偶联物（ADC）的抗体及其靶点 2. 抗体药物偶联物（ADC）的连接子（可裂解/不可裂解、结构及机制） 3. 抗体药物偶联物（ADC）的毒素/载荷（分类与功能） 4. 抗体药物偶联物（ADC）的偶联位点 抗体药物偶联物（ADC）生产、质量控制及功能检测综述 参考文献

产品介绍

抗体药物偶联物（ADC）是新一代治疗药物，由抗体、小分子药物（载荷）以及连接抗体和载荷的连接子组成。导航器靶向特定肿瘤细胞，小分子进入肿瘤细胞将其杀死。ADC可能成为许多癌症患者的新型治疗方式。为满足ADC开发的需求，GeneMedi提供超过100种ADC产品。

通过以下链接查看抗单甲基奥瑞他汀E（MMAE）小鼠单克隆抗体的产品信息：https://www.genemedi.net/i/anti-monomethyl-auristatin-e-mmae-monoclonal-antibody

案例研究：抗体药物偶联物（ADC）产品数据

抗体	载荷	质量控制
Ab-001	VCMMAE	SDS-PAGE（还原和非还原）
人IgG1对照		DAR
Ab-002		细胞毒性试验

首先，我们使用了更高剂量的还原剂（TCEP）和小毒性分子（vcmmae）以确保偶联成功。SDS-PAGE（还原DTT和非还原DTT）结果表明，我们成功将MMAE连接到抗体上。以下是您需要的偶联物生产。

2.1 人IgG1-ADC：SDS-PAGE（还原）和SDS-PAGE（非还原）

2.2 DAR检测

在本批次中，我们选择了5.4当量TCEP和10.8当量VCMMAE组进行DAR检测。我们的样品DAR与标准品几乎相同，但抗体完整性结果不如标准品。

2.3 细胞毒性试验

接下来，我们进行了细胞毒性试验，观察ADC对293细胞的毒性作用。同时，考虑到ADC的储存和运输，我们对ADC进行了冻干处理，并比较了未冻干对ADC细胞毒性的影响。
显然，与空白组相比，ADC对293细胞的生长有显著抑制作用。此外，冻干可以降低ADC对细胞生长的抑制。

结果显示，当还原剂TCEP当量为0.4和1.5时，结果没有规律性，这可能是由于二硫键打开有限和小分子偶联有限所致。然而，当TCEP当量为3时，结果与之前的PTM-1-ADC（5.4t5.4v和5.4t10.8）相匹配。我们还用PTM-1-ADC处理了293-ko细胞系，显然，细胞死亡与ADC剂量之间没有规律性关系。

图。ADC（人IgG1-MMAE）的质量控制和功能验证。
图A（SDS-PAGE，DTT）和图B（SDS-PAGE，无DTT）：泳道2为裸人IgG1；泳道3为人IgG1阳性对照。泳道4-7：抗体用不同当量的还原剂（TCEP）处理后，加入不同当量的偶联小分子（MMAE）。
图C和图D：LC-MS检测ADC的DAR（药物抗体比）。图C为阳性对照，图D为我们自制的ADC。两者均为人IgG1-MMAE。
图E和图F：ADC细胞毒性试验。

GeneMedi的抗体药物偶联物（ADC）产品列表

什么是抗体药物偶联物（ADC）？——引言

1. 抗体药物偶联物（ADC）的结构

ADC由抗体和载荷组成，连接子连接抗体和小分子药物。ADC药物进入血液后，其抗体部分会识别并结合靶细胞表面抗原，然后通过内吞作用将ADC-抗原复合物内化进入细胞，复合物被溶酶体降解并释放载荷，从而破坏DNA或微管，或发挥拓扑异构酶/RNA聚合酶的抑制作用，导致细胞死亡。它具有精准性和巨大杀伤力的特点，是新一代治疗药物。¹

2. 抗体-药物偶联物（ADC）的细胞处理

ADC由靶向特定肿瘤细胞的导航分子（抗体）和能进入肿瘤细胞杀死它们的小分子组成，因此如何在血液中保持活性以实现良好的递送效果也是一个问题。当然，精确靶向可以大大减少误杀效应。当ADC被细胞内吞后，溶酶体酶会水解导弹（抗体）的导航部分，从而释放细胞毒性小分子。因此，它可以阻断细胞内的一系列活动，包括DNA和RNA的转录和翻译。它还可以通过影响微管蛋白来阻断蛋白质的运输。最终，它可以杀死肿瘤细胞。因此，这里我们需要关注脱靶的后果以及小分子载荷对正常组织和细胞的潜在危害。许多临床药物在II期和III期的暂停也与这两个关键点密切相关。

图2. ADCs的细胞处理过程。大多数ADC通过类似的机制释放细胞毒性载荷。通常，ADC被设计为内化，并通过内吞途径处理，导致载荷释放和细胞毒性效应。²

3. 抗体-药物偶联物（ADC）如何工作？ADC的作用机制（MOA）

ADC中的药物可以识别肿瘤细胞的膜蛋白，然后定位靶细胞。内吞进入细胞后，溶酶体水解并释放ADC中的小分子。例如，VCMMAE是抗体偶联药物（ADC）中的一种抗有丝分裂剂。它由单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和二肽缬氨酸瓜氨酸（VC）交联而成。VCMMAE通过阻断微管蛋白聚合而成为一种强效的抗有丝分裂剂。VCMMAE通过阻断微管蛋白聚合有效抑制有丝分裂并杀死细胞。微管在细胞功能中发挥重要作用，参与迁移、运输和重组，并具有许多动态作用，包括运动蛋白的运动和细胞分裂过程中染色体的分离。

抗体-药物偶联物（ADC）在临床中的应用（已获批/BLA，I/II/III期）

1. FDA批准用于临床的抗体-药物偶联物（ADC）

临床上，FDA批准的大多数ADC药物均为IgG1，靶点包括CD33、CD22、HER2等。最常见的载荷是MMAE，此外还有卡奇霉素、DM1。ADC药物主要用于抗肿瘤领域，是近年来的热门研究方向之一。目前，全球已有11款ADC药物获批，包括Mylotarg（辉瑞）、Adcetris（Seattle genetics / Takeda）、Kadcyla（罗氏）、Besponsa（辉瑞）、Lumoxiti（阿斯利康）、Polivy（罗氏）、Padcev（Seattle genetics / anstelai / MSD）、Enhertu（阿斯利康 / first third party）、Trodelvy（immunomedicine）、Blenrep（GSK）、Akalux（Rakuten Aspyrian）。³从已上市药物的研发企业来看，辉瑞、西雅图遗传学、罗氏和阿斯利康各有两款产品，其他三家公司各有一款产品。

2. 目前处于临床研究中的抗体-药物偶联物（ADC）

目前，在clinicaltrials.gov注册的癌症患者临床试验中，有150项活性试验涉及82种新型ADC。大多数ADC目前处于I期临床试验阶段，而少数已进入III期。在150项正在进行的试验中，超过80%评估ADC在实体瘤中的安全性和有效性，而不到20%的试验是针对血液恶性肿瘤。这里按设计用于识别它们的ADC数量分类，共43个公开靶点。大多数靶点仅由一种ADC评估，而一些靶点由多种不同的ADC研究。在这82种新型ADC中，其次是DNA-damaging分子、拓扑异构酶I抑制剂，最后是独特的载荷，如TLR激动剂、一种BCL2-xL抑制剂和一种RNA聚合酶II抑制剂。许多载荷无法公开。大多数临床研究中的ADC要么采用传统的半胱氨酸偶联策略，要么采用位点特异性偶联连接子，而少数偶联到表面赖氨酸上。⁴

3. 临床试验中的新型抗体-药物偶联物（ADC）

目前有超过80种ADC处于活跃的临床试验中，其中大多数处于I期和I/II期。超过80%的临床试验正在评估ADC在各种实体瘤中的安全性和有效性，其余试验涉及血液恶性肿瘤。HER2是目前ADC开发中最具吸引力的靶点之一，有三种抗HER2 ADC目前处于III期试验。其中一种抗HER2 ADC是RC48，由荣昌生物（RemeGen）生产，通过可被蛋白酶切割的缬氨酸-瓜氨酸连接子，经半胱氨酸偶联，将IgG1抗HER2抗体赫妥珠单抗（hertuzumab）与大约四个MMAE分子连接。⁵

抗体-药物偶联物（ADC）的主要组成部分

1. 抗体-药物偶联物（ADC）的抗体及其靶点

1.1 Mylotarg®（吉妥珠单抗奥唑米星）来自惠氏/辉瑞，是首个上市的ADC。它由重组人源化抗CD33单克隆抗体（IgG4κ抗体hP67.6）通过pH敏感的腙连接子共价连接至卡奇霉素衍生的载荷（N-乙酰基-γ-卡奇霉素1,2-二甲基肼二氯化物）组成。


1.2 Adcetris®（本妥昔单抗维多汀）来自Seagen（原西雅图遗传学），包含一个CD30-specific单克隆抗体与单甲基奥瑞他汀E（MMAE）偶联，于2011年获得FDA批准，成为第二个进入肿瘤市场的ADC。


1.3 2013年，Kadcyla®（阿多曲妥珠单抗恩坦辛）由基因泰克/罗氏开发和上市，作为首个获批用于治疗实体瘤的ADC，彻底改变了ADC领域。它被批准作为辅助（术后）治疗，用于既往接受过曲妥珠单抗（Herceptin®）和紫杉烷（单独或联合）治疗的HER2+早期乳腺癌患者。


(A) Kadcyla®（阿多曲妥珠单抗恩坦辛）的结构。抗体以蓝色表示，连接子和载荷的化学结构分别以红色和绿色表示。(B) 美登素和DM1的化学结构。DM1的硫代丙酰基（允许与马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯（MCC）基团偶联）以红色框标示。

1.4 Besponsa®（伊珠单抗奥唑米星（辉瑞/惠氏））于2017年获得FDA批准，针对CD22+ B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）。第一个区别在于单克隆抗体，因而抗原靶点和癌症适应症不同。Besponsa®中使用的重组人源化IgG4单克隆抗体（G544）选择性地针对所有成熟B-ALL患者B细胞上表达的CD22，以及>90%的前体B-ALL患者。n.


1.5 Polivy 和 Padcev Polivy® 是由 Genentech/Roche 使用 Seagen 开发的专有技术研发的一种抗 CD79b ADC。它联合苯达莫司汀和利妥昔单抗用于治疗至少接受过两种先前治疗的复发或难治性弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL，一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤）成人患者。该适应症基于完全缓解率获得加速批准。Polivy® 的 DAR（药物抗体比）约为 3.5，即每个抗体上连接约 3.5 个 MMAE 分子。

Padcev® 由 Astellas Pharma Inc. 和 Seagen 生产销售，是一种靶向 Nectin4 的 ADC。它于 2019 年首次获得加速批准，用于治疗既往接受过程序性死亡受体-1（PD-1）或程序性死亡配体-1（PD-L1）抑制剂以及含铂化疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌成人患者。2021 年，该适应症获得常规批准，同时 Padcev® 获得加速批准，用于不适合含顺铂化疗且既往接受过至少一种治疗的患者。Padcev® 由哺乳动物（中国仓鼠卵巢）细胞产生的全人源化抗 Nectin4 IgG1κ 单克隆抗体（AGS-22C3）组成，DAR 约为 3.8。

1.6 Enhertu®（fam-trastuzumab deruxtecan-nxki）由第一三共/阿斯利康开发，于 2019 年 12 月获得 FDA 加速批准，用于治疗接受过两种或以上抗 HER2 治疗的不可切除或转移性 HER2 阳性乳腺癌成人患者。该 ADC 由抗 HER2 抗体、蛋白酶可裂解的四肽连接子和药物载荷 DXd 组成。


2020 年 4 月，Trodelvy® 获得 FDA 加速批准，用于治疗至少接受过两种转移性疾病治疗的局部晚期或转移性三阴性乳腺癌（mTNBC）患者。Trodelvy® 由全人源化 hRS7 IgG1κ 抗体（靶向 TROP2，即滋养层抗原 2）通过酸敏感性可水解连接子 CL2A 与 SN-38（伊立替康的活性代谢物）偶联而成。


葛兰素史克的 ADC Blenrep®（belantamab mafodotin-blmf）是首个获批的抗 BCMA（B 细胞成熟抗原）疗法。它于 2020 年 8 月获得 FDA 加速批准，用于治疗至少接受过四种先前治疗的复发或难治性多发性骨髓瘤成人患者，包括抗 CD38 单克隆抗体、蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂。Blenrep® 由无岩藻糖基化的人源化 IgG1 单克隆抗体通过不可裂解的马来酰亚胺己酰基连接子与微管蛋白抑制剂单甲基澳瑞他汀 F（MMAF）偶联而成。除了 MMAF-induced 凋亡外，通过 ADCC 和 ADCP 效应功能进行的肿瘤细胞裂解也产生继发抗肿瘤活性。


Zynlonta®（loncastuximab tesirine-lpyl）由 ADC Therapeutics 开发，是一种 CD19-directed ADC，用于治疗接受过两种或以上全身治疗的复发或难治性大 B 细胞淋巴瘤成人患者，包括弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）、未特指型由低级别淋巴瘤转化的 DLBCL 以及高级别 B 细胞淋巴瘤。它于 2021 年 4 月获得 FDA 加速批准。Zynlonta® 由人源化 IgG1κ 单克隆抗体通过蛋白酶可裂解的缬氨酸-丙氨酸连接子与细胞毒性吡咯并苯并二氮杂䓬（PBD）二聚体烷化剂 SG3199 偶联而成。


2021 年 9 月下旬，FDA 批准 Tivdak®（tisotumab vedotin-tftv）加速上市，成为当时最新获批的 ADC。Tivdak® 由 Seagen 和 Genmab 共同开发，是首个且唯一获批用于治疗化疗后疾病进展的复发或转移性宫颈癌成人患者的 ADC。Tivdak® 是一种靶向组织因子（TF）的 ADC，由人抗 TF IgG1κ 抗体通过蛋白酶可裂解的 mc-vc-PABC 连接子（与 Adcetris®、Polivy® 和 Padcev® 相同的连接子结构）与 MMAE 偶联而成。与前述 ADC 类似，Tivdak® 每个抗体平均携带 4 个 MMAE 分子。此外，体外研究表明该 ADC 还能介导 ADCP 和 ADCC 效应功能，从而提供多模式抗肿瘤活性。


随着 ADC 的临床开发，人们逐渐认识到，适用于标准化疗或单独抗体疗法的规则不一定适用于 ADC。ADC 本质上是模块化的，其组件可以互换，并可通过战略性改变来改善其疗效和毒性特征。¹³

2. 抗体药物偶联物（ADC）的连接子（可裂解/不可裂解、结构和机制）

表2. 化学触发剂

连接子不仅是将抗体与小分子药物载荷共价连接的分子部分，也是靶向药物疗法中具有设计特性的关键元素。连接子的添加不应诱导聚集，并且需要确保可接受的药代动力学特性，限制载荷在血浆中的过早释放（稳定性），并在靶作用位点有效释放活性分子。在连接过程中，有许多偶联公司。连接子分为两种类型：不可裂解连接子和可裂解连接子。⁶

基于不可裂解连接子的 ADC 必须被内化，抗体部分需要被溶酶体蛋白酶降解以释放活性分子。在 ADC 开发中已经探索了许多不可裂解连接子。最具代表性的是用于 Kadcyla 的 N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）。⁷


该结构的分解代谢导致 Lys-SMC-DM1 成为主要的肿瘤代谢物。此外，与此连接子连接的药物通常不具有旁观者杀伤效应，因为释放的代谢物渗透性差。目前的研究主要集中于可裂解连接子。^[11-12]

可裂解连接子的使用对于设计内化和非内化 ADC 同样可行，因为释放是由裂解位点的性质（溶酶体和/或肿瘤环境）触发的。连接子可分为两类：酶依赖型和化学依赖型（即非酶依赖型）（两者均涉及偶联制造）。

化学依赖型连接子：含二硫键的连接子受到硫醇攻击，释放活性载荷。尽管血浆中还原型人血清白蛋白（HSA）是最丰富的硫醇，但其对大分子的反应性很差。⁸细胞质中也含有高水平的谷胱甘肽（GSH），一种含巯基的三肽，易于与亲核蛋白反应。血液中 GSH 浓度（微摩尔范围）与细胞质中 GSH 浓度（毫摩尔范围）的差异以及癌细胞引起的氧化应激有助于药物在癌细胞中的优先释放。含二硫键的连接子主要与美登素类载荷相关。二硫键的反应性可通过空间位阻调节：α-甲基取代显著影响还原速率和对硫醇二硫键交换的抵抗力。例如，sar-3419 的连接子通过二甲基取代获得了 spdb-DM4 的最佳抗肿瘤活性。


腙连接子表现出 pH 依赖性稳定性，在中性 pH 下稳定，在酸性介质中水解（pH<5），并已成功应用于 immu-110，该药含有可裂解的酰腙连接子，由 4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯（MCC）的酰肼与阿霉素中的酮基反应形成。

腙连接子也常用于卡奇霉素家族的载荷。在这种情况下，释放由两步激活过程触发：第一步是酸敏感性腙的水解，第二步是二硫键被 GSH 还原，使巯基中间体环化。该连接子已用于已上市的 Mylotarg 和 Besponsa，但它们在血浆中的稳定性不如预期，且不如其他可裂解连接子有吸引力。


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酶依赖性连接子: 为了限制内化前 payload 的释放，从而防止或最小化靶细胞降解，溶酶体的蛋白质成分成为寻找能够降解 ADC 并以高浓度存在的酶的合理场所。

组织蛋白酶-B

组织蛋白酶 B 是一种半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳动物的晚期内体和溶酶体中，并在许多癌细胞中过表达。最初，可切割的二肽作为阿霉素前药的组织蛋白酶 B 底物。该工作建立了二肽的 SAR：P1 位需要亲水性残基（瓜氨酸或精氨酸），而 P2 位的亲脂性残基增强血浆稳定性（苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸）。

此外，引入了自降解间隔区以促进酶进入，从而限制 payload 的空间位阻：在酸性介质中，对氨基苄氨基甲酸酯（PABA）自发性 1,6-消除，释放二氧化碳、对氮杂醌甲酰胺和阿霉素。最终，这一发现从前药领域转移到 ADC 领域，证明了 Val-CIT 和 Phe-Lys 二肽连接子的抗原驱动细胞活性。⁹


Val-Cit 二肽是 ADC 中最常用的可切割连接子。目前，临床阶段有多达 25 种分子，这可能是由于其整体良好的血浆稳定性、释放行为和化学可操作性。两种已批准的 ADC 药物（Adcetris 和 Polivy）使用相同的连接子 MC-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺间隔区、标准 Val-CIT 二肽序列作为组织蛋白酶底物以及 PABC 自降解间隔区。


Val-Ala 二肽也被广泛使用。临床阶段有七种分子。进展最快的是 Loncastuximab tesirine，它包含一个 PEG 化间隔区以平衡属于 PBD 二聚体家族的 payload sg3199 的亲脂性。

研究表明，Val-CIT 由于沉淀和聚集而难以实现高 DAR。相比之下，Val-Ala 连接子允许 DAR 高达 7.4，且聚集有限（
一些研究比较了 Val-CIT 和 Val-Ala 二肽与 MMAE 连接的 payload 结构。在非内化抗体的情况下，与工程化半胱氨酸结合的 Val-CIT 和 Val-Ala 连接子显示出相似的特征，并且比 Val-Lys 和 Val-Arg 类似物性能更好。在具有随机半胱氨酸结合的抗 HER2 ADC 的情况下，Val-Ala 在高 DAR 结构中比 Val-CIT 显示更少的聚集。另一方面，两种连接子表现出相似的缓冲液稳定性、组织蛋白酶 B 释放效率、细胞活性和组织病理学特征。四肽 Gly-Gly-Phe-Gly 显示了稳定有效的可切割连接子的所有特征，并被已上市的 ADC 药物 Enhertu 使用。Enhertu 早期是一种血浆稳定的 ADC，DAR 为 7.7。蛋白酶降解发生在溶酶体中，释放 dx-8951f，这是一种源自 exatecan 的有效拓扑异构酶 I 抑制剂。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的 DAR 是非常值得注意的，因为它与广泛建立的原理（即高 DAR 偶联物可能具有较差的药代动力学特征）相矛盾。这里使用的自降解间隔区是简单紧凑的半胺化，而不是 Val-CIT 连接子使用的 PABC。


磷酸酶和焦磷酸酶

与组织蛋白酶类似，焦磷酸酶和磷酸酶是选择性表达在溶酶体中的水解酶。2016 年，默克研究人员设计了一种含有磷酸和焦磷酸的连接子，与组织蛋白酶 b 敏感的 Val-CIT-PABA 配对以递送糖皮质激素：磷酸/焦磷酸部分结合在自降解间隔区 PABA 和 payload 之间。内化后，payload 可以按顺序释放：组织蛋白酶 B、自降解间隔区和磷酸酶（n=1）。对于焦磷酸（n=2），可能需要另一步涉及焦磷酸酶。


这种亲水性且带永久电荷的基团具有溶解性优势。它不仅可以与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，还可以促进 ADC 的纯化。ADC 中残留的连接子低于 0.10%。含有磷酸和焦磷酸的 ADC 在体外具有活性。

β-葡萄糖醛酸酶

β-葡萄糖醛酸酶是催化 β-葡萄糖醛酸残基水解的糖苷酶，在溶酶体和肿瘤基质中高表达。西雅图遗传学研究人员于 2006 年发表了一项开创性工作。抗 CD70 ADC 使用含有葡萄糖醛酸的连接子，该连接子连接到自降解间隔区。该连接子表现出低水平的聚集、高血浆稳定性和强大的体内疗效。¹⁰


该连接子也通过额外的二甲基乙二胺（DMED）自降解间隔区应用于其他含胺 payload，如喜树碱类似物、sn38、杜卡霉素和苦参碱。释放顺序为：从水解 β-葡萄糖醛酸到自降解间隔区，然后 DMED 自发发生另一环化反应，形成 1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，最终释放含羟基药物。由于连接子的亲水性，与组织蛋白酶敏感性连接子相比，该技术使制备 DAR=8 的 ADC 更容易。


β-半乳糖苷酶

最近，有一种方法使用 β-半乳糖苷酶切割 ADC 的连接子，该连接子包含 PEG10 间隔区。间隔区被硝基取代以提高自降解速率。类似于 β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解 β-半乳糖苷酶部分，从而赋予化学前体亲水性。另一个优点是 β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而 β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体和实体瘤微环境中均有表达。研究表明，在释放 MMAE 的抗 HER2 ADC 背景下，含有 β-半乳糖苷酶连接子的 ADC 在体外和体内比 T-DM1 更有效。


硫酸酯酶

最近，出现了由硫酸酯酶切割的连接子，硫酸酯酶在多种癌症类型中过表达并显示出潜在的选择性。该研究涉及负载 MMAE 的抗 HER2 抗体。与经典的可切割 Val-Cit 和 Val-Ala 连接子相比，硫酸酯酶连接子在 HER2⁺细胞系上显示出相似的效力。

3. 抗体药物偶联物（ADC）的毒素/载药（分类和功能）

有很多 payload，如 MMAE、Calicheamicin、MMAF、DM1、SN-38 和 Dxd。

3.1. 微管破坏药物

a. 金盏花

奥瑞他汀（Auristatins）是ADC中使用的重要载荷。最著名的家族成员MMAE存在于两种已上市药物中：Adcetris和Polivy。目前，有超过10种以金盏花（如MMAE）或甲基金盏花素F（MMAF）为载荷的ADC正在进行临床试验。


上图描述了奥瑞他汀（auristatine）及其常见的连接位点。金盏花的构效关系（SAR）已被广泛研究，主要集中在末端亚基：P1（N端）和P5（C端）。最常见的方法是在P1上引入氨基甲酸酯官能团。

b. 美登素衍生物（DM2, DM4）

美登素（Metanthin）是一种非常有效的微管组装抑制剂，可诱导细胞有丝分裂停止。然而，这种结构难以偶联，因为它没有反应性官能团。为了克服这个问题，创建了一系列含有SME基团的非常有效的衍生物。这类分子的第一例是DM1和DM4，它们带有甲基硫代丙酰基而不是天然的N-乙酰基。


c. 微管溶素

微管溶素（Tubulysins）是微管聚合的有效抑制剂，可导致分裂细胞的细胞骨架快速解体并引发凋亡。它们是一个天然存在的四肽家族，包含Mep、Ile、Tuv和Tut，R3 = OH或Tup，R3 = H。


d. 隐霉素

隐霉素（CR）是一个具有抗肿瘤活性的六元大环二肽家族。现有临床试验结果表明，在达到治疗效果所需的剂量下，毒性水平不可接受。


e. 抗有丝分裂Eg5抑制剂

纺锤体驱动蛋白（KSP，也称为Eg5或kif11）是一种ATP依赖性运动蛋白，参与细胞周期中心体的分离。因此，用KSP抑制剂（kspis）阻断有丝分裂中的这一重要事件可以产生抗肿瘤疗效。

3.2 DNA损伤药物

a. 吡咯苯并二氮杂卓类和吲哚氯苯并二氮杂卓类

吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓（PBD）是一种具有抗肿瘤活性的天然产物。它们的作用模式是在DNA小沟中选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD上的亲电性N10/C11亚胺形成共价键。

b. 杜卡霉素

杜卡霉素是一种强大的细胞毒性物质。它通过其高活性环丙烷环与DNA小沟结合，并在N3位点烷基化腺嘌呤。非环化的卤甲基形式的杜卡霉素显著降低了其细胞毒性活性。由于分子中的酚基可用作外消旋活化剂以形成亲电性环丙烷，因此在开发杜卡霉素ADC时，连接策略集中于酚官能团的连接。

c. 喜树碱

喜树碱（CPT）及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂的经典例子。它们稳定由拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-top1-抑制剂复合物遇到复制叉时发生DNA双链断裂。天然喜树碱是一个五环结构，其极低的溶解度阻碍了其作为癌症治疗药物的广泛应用。伊立替康是其水溶性前药，已获批用于转移性结直肠癌的治疗。SN-38是伊立替康的活性代谢物，在体内通过人肝脏羧酸酯酶的作用产生，该代谢物可通过打开内酯环而失活。


d. 卡奇霉素

卡奇霉素是一类被广泛研究的烯二炔抗生素。其结构和作用机制特别有趣且复杂，使其成为ADC载荷领域的一类抗生素。在ADC中连接卡奇霉素的策略以市售ADC Mylotarg和Besponsa为例。

3.3 创新药物

a. 凋亡诱导剂（BCL XL抑制剂）

抗凋亡Bcl-2家族成员（包括BCL XL）的过度表达是癌细胞获得凋亡抵抗的机制之一。阻断BCL XL上BH3结合结构域的药物可触发癌细胞凋亡。

b. 特拉那司汀及其类似物

目标剪接体是一个参与mRNA加工的大核糖核蛋白复合物，为靶向癌症治疗提供了有前景的治疗选择。几种天然产物可以通过结合不同的剪接亚基来抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以结合剪接体的SF3B亚基，阻止RNA剪接。


c. 鹅膏蕈毒素

在ADC技术领域，使用类似鹅膏蕈碱的转录抑制剂是一种相对较新的方法。九种天然存在的鹅膏蕈碱衍生物具有相同的骨架结构。一个由八个L-构型氨基酸组成的大环，通过亚砜部分连接在色氨酸和半胱氨酸残基之间。鹅膏蕈碱的三个侧链被羟基化，OH基团具有良好的水溶性并与靶分子结合。两种肽，α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽，占所有毒素的90%。


d. 烟酰胺磷酸核糖基转移酶

烟酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）是一种负责将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶。其抑制剂已在各种临床前和临床研究中显示出有效性，但其临床应用受到靶向毒性和剂量限制性毒性的限制，例如血小板减少症和胃肠道不良反应。

e. 卡霉素

从库拉索细菌中分离出两种新的蛋白酶抑制剂，卡霉素A和卡霉素B。

4. 抗体药物偶联物（ADC）的偶联位点

生物偶联技术 基于化学的特异性原位抗体修饰

单克隆抗体的自然结构为生物偶联提供了多种可能性。化学和特异性的天然（非工程化）抗体偶联具有一些优势。它可以避免抗体特定位点突变的复杂性以及细胞培养扩增和优化中可能遇到的挑战。

根据抗体序列，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等内源性氨基酸的二硫键之间的连接位点非常有吸引力。直到2021年，所有FDA批准的ADC都使用这些内源性氨基酸进行偶联。然而，抗体支架也含有聚糖，这是由于单克隆抗体生产过程中Fc区的翻译后修饰造成的。一些研究报道了糖工程的新策略，这似乎是生物偶联的一个有趣替代方案。

内源性氨基酸偶联

最常见的偶联方法之一是利用抗体的赖氨酸残基上的亲核NH2基团，与连接载荷上的亲电N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团反应。尽管反应简单，但可用的赖氨酸残基丰度高，导致在随机分布下形成许多ADC的不均匀混合物。DAR由抗体药物偶联物的化学计量控制，该方法被广泛使用，包括已批准的ADC如Besponsa、Mylotarg和Kadcyla。

二硫键再桥接策略

IgG抗体含有四个链间二硫键，两个连接轻链和重链，两个位于连接两条重链的铰链区。它们维持单克隆抗体的完整性。另一种经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为载荷附着点的作用。四个二硫键的还原通常产生八个巯基，这些巯基可以与马来酰亚胺的连接子反应，生成DAR=8的ADC。


Dorona及其同事报道了一个ADC的例子，其使用嵌合抗CD30单克隆抗体偶联MMAE，DAR=8。与经典的赖氨酸偶联相比，这种载荷加载方法更可控。然而，据报道血浆清除率会更高，而血浆聚集的风险会降低。

2015年，chudasama等人引入了一种新型的再桥接试剂，二溴哒嗪二酮。他们证明它可以有效插入二硫键，所得结构即使在高温下也表现出优异的水解稳定性。然而，随着还原步骤温度的升高，也观察到异质性，并且该结构还允许选择性引入不同的官能团。

二乙烯基嘧啶是另一种有效的再桥接试剂，可产生Dar=4的稳定ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基骨架对半胱氨酸再桥接的影响。他们认为，用嘧啶替代吡啶可以使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，其在高温下表现出更高的效率。

为了避免经典马来酰亚胺偶联导致的体内不稳定性缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰苯基噁二唑，其对半胱氨酸具有特异性反应。它们在血浆中比半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物更稳定。受此启发，Zeglis设计了dipods试剂，其包含两个通过苯基连接的噁二唑甲磺酰基部分。Dipods以再桥接方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，这种偶联方式在体外稳定性和体内性能上更优越。

聚糖偶联

由于IgG是一种糖蛋白，其在Fc片段每条重链的CH2结构域的n297处含有一个N-聚糖。这种糖基化可以作为连接载荷的附着点。多糖与Fab区域之间的长距离定位降低了偶联后损伤抗体抗原结合能力的风险。此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使其成为合适的偶联位点。

聚糖生物偶联可根据靶向碳水化合物的技术进行区分：包括聚糖代谢工程、糖基转移酶处理后的聚糖氧化、内切糖苷酶和转移酶处理的酮或叠氮标记。


Neri等人报道了在IgG抗体的N-糖基化位点对岩藻糖进行位点特异性修饰。这种糖含有适合选择性氧化的顺式二醇部分。他们使用偏高碘酸钠氧化岩藻糖残基，形成醛基，可与含肼的连接子反应，使抗体通过腙键连接到药物上。

Senter及其同事将硫基类似物添加到细胞培养基中，通过代谢将6-硫代岩藻糖引入抗体修饰。他们认为，这种取代是通过劫夺岩藻糖基化途径完成的，该途径引入了化学位点以实现位点特异性结合。与经典的半胱氨酸偶联物相比，该方法显著降低了异质性水平，并产生了具有更可预测的药代动力学和药效学特性的偶联物。

重组IgG中很少含有唾液酸。然而，已证明聚糖可以通过半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶进行酶促修饰。通过酶促反应添加半乳糖获得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。这种修饰通过高碘酸盐氧化产生醛基，可以将连接载荷与羟胺基团偶联。该偶联物具有高靶向选择性和良好的体内抗肿瘤活性。高碘酸盐也可氧化敏感氨基酸如甲硫氨酸，并影响与FcRn的结合。

工程化抗体的位点特异性生物偶联

生物正交化学和蛋白质工程的进展有助于生成更均一的ADC。尽管天然单克隆抗体上有很多连接方法，但工程化抗体上的位点特异性生物偶联可以更有效地控制DAR，并避免改变与抗原结合亲和力。通过这种方式，在某些位置添加天然或非天然氨基酸，以获得具有优异药代动力学和药效学特性的均一产物。

酶法

通过将特定的氨基酸标签插入抗体序列，可以以高度选择性的方式实现载荷的连接。这些标签被特定酶识别，如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物转谷氨酰胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而可以进行位点特异性偶联。

Aaron等人探索了一种新的醛基标记蛋白位点特异性偶联方法。该技术利用基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达过程中共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过腙基（hydrazino Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。


微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也经常被开发用于定位特异性偶联。MTGase催化糖基化抗体第295位谷氨酰胺侧链与底物伯胺之间肽键的形成。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有伯胺，就没有结构限制。


谷氨酰胺残基天然存在于McAb每个重链的Fc区。在295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，产生DAR=2的均一ADC。为提高效率，可偶联带有支链的连接子以使DAR翻倍，将297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可以增加DAR。

NBE Therapeutics开发了基于金黄色葡萄球菌转肽酶A介导的偶联方法。他们的策略使用转肽酶A（srtA）切割lpxtg（X=任意氨基酸）五肽基序中苏氨酸和甘氨酸之间的酰胺键，然后催化甘氨酸相关载荷与新形成的C末端在生理温度和pH下形成肽键。


该方法应用于不同的抗体，如抗CD30和抗HER2，并将美坦辛和MMAE与5-甘氨酸标记的连接子偶联。两种ADC在体外细胞毒性方面与经典偶联相似。通过酶法制备的曲妥珠单抗美坦辛在体内测试中与Kadcyla完全匹配。另一个例子中，通过转肽酶法生成了高效蒽环类毒素衍生物pnu-159682的ADC。有趣的是，通过该技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，制备的pnu-159682 ADC在体内外具有高稳定性，并显示出比含有微管靶向载荷的ADC更优的疗效。

工程化非天然氨基酸的生物偶联

除了硫代单克隆抗体技术，添加非标准氨基酸（NCAA）为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用具有独特化学结构的氨基酸，可以通过化学选择性方式引入连接子-载荷复合物。该技术需要重组抗体序列，使用与宿主细胞中所有内源tRNA和合成酶正交的tRNA和氨酰-tRNA合成酶（AARS），响应未分配的密码子将NCAA导入蛋白质。通常，在发酵过程中向培养基中添加NCAA。非天然氨基酸的选择很重要，因为它们可能刺激免疫原性。常用的NCAA是具有独特基团的天然氨基酸类似物，如酮基、叠氮基、环丙烯基或二烯基。

抗体药物偶联物（ADC）生产、质量控制及功能检测综述

1. SDS-PAGE

我们需要进行SDS-PAGE（还原性和非还原性DTT）以观察抗体的完整性，并初步观察小分子的连接情况。通常，我们可以看到偶联抗体相对于裸抗体向上迁移。

2. DAR（方法和标准）

ADC药物本质上是混合物，由连接不同数量小分子药物的mAb组成。DAR代表每个mAb连接的小分子药物平均数量。DAR直接影响ADC药物的疗效和安全性。在药物开发阶段，应尽量减小DAR值的变化范围。ADC药物的偶联位点分为赖氨酸残基上的氨基和半胱氨酸残基上的巯基。赖氨酸偶联的DAR通常较小，但潜在的偶联位点很多，偶联反应随机，产物异质性大；ADC药物开发中使用4对链间二硫键。抗体通过部分还原将链间二硫键转化为游离半胱氨酸残基，半胱氨酸残基中的巯基与连接子中的马来酰亚胺基团反应形成ADC。目前，大多数正在使用或开发的ADC依赖于链间二硫键半胱氨酸进行偶联，其中4个（IgG1和IgG4）或6个（IgG2）链间二硫键被过量还原剂（如三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇）还原。这不会破坏链内二硫键，同时释放参与链间二硫键的半胱氨酸残基的巯基（图3e）。所得产物是ADC的混合物，每个亲本IgG1或IgG4含有0-8个药物，每个IgG2含有0-12个药物，ADC混合物中主要为偶数DAR（0、2、4、6、8、10、12）的组分。

2.1 紫外/可见光谱法（UV/VIS）

紫外/可见光谱法是检测DAR值最简单、稳定的方法。该方法要求抗体和小分子药物具有不同的最大吸收波长，通过分别计算其浓度得到ADC的DAR值，适用于多种ADC。

2.2 色谱法

色谱法包括疏水相互作用色谱（HIC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC），适用于半胱氨酸偶联ADC的测定。疏水相互作用色谱可根据疏水性差异分离不同DAR值的组分，并保持ADC分子的结构完整性；反相高效液相色谱需要在分析前将抗体还原为轻链和重链，可用于补充和验证疏水相互作用色谱的结果，并适用于质谱分析。

2.3 质谱法

质谱法适用于赖氨酸偶联ADC的DAR值测定，包括液相色谱串联质谱和MALDI-TOF-MS。赖氨酸偶联ADC异质性较强，增加了质谱分析的难度。通常需要在测定前对ADC进行额外预处理，如去糖基化和去除C末端赖氨酸异质性。

3. ADC的细胞毒性检测

确定抗体的DAR后，需要进行ADC的细胞毒性实验。用不同剂量的ADC处理细胞并分析其EC50。在体外细胞毒性实验中，对照组细胞敲除了靶基因，因此抗体失去了定位作用，无法杀死肿瘤细胞，没有剂量规律性。然而，从未被敲除的细胞处理结果来看，通常具有更好的杀伤效果和EC50。

参考文献