抗体药物偶联物（ADC）的主要元素：连接子（可裂解/不可裂解，结构和机制）
连接子不仅是抗体与小分子载荷之间形成共价连接的分子部分，也是靶向药物疗法中具有设计特性的关键要素。添加连接子不应诱导聚集，并且需要确保可接受的PK特性，限制载荷在血浆中的过早释放（稳定性），并在靶向作用位点有效释放活性分子。在连接过程中，有许多偶联公司。连接子分为两种类型：不可裂解连接子和可裂解连接子。1基于不可裂解连接子的ADC必须被内化，抗体部分需要被溶酶体蛋白酶降解以释放活性分子。在ADC的开发中已探索了许多不可裂解连接子。最具代表性的是n-琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC），用于Kadcyla。2
该结构的分解代谢导致Lys-SMC-DM1成为主要的肿瘤代谢物。此外，与此连接子连接的药物通常不具有旁观者杀伤效应，因为释放的代谢物渗透性差。目前的研究主要集中在可裂解连接子上。[6-7]可裂解连接子的使用对于内化性和非内化性ADC的设计同样是可行的，因为释放由裂解位点的性质（溶酶体和/或肿瘤环境）触发。连接子可分为两类：酶依赖性和化学（即非酶）依赖性（两者均涉及偶联制造）。化学依赖性连接子: 含有二硫键的连接子受硫醇攻击以释放活性载荷。尽管血浆中的人血清白蛋白（HSA）还原形式是最丰富的硫醇，但其对大分子的反应性非常差。3细胞质中还含有高水平的谷胱甘肽（GSH），这是一种含巯基的三肽，易于与S-亲核蛋白反应。血液（微摩尔范围）和细胞质（毫摩尔范围）中GSH浓度的差异以及癌细胞引起的氧化应激有助于药物在癌细胞中的优先释放。含有二硫键的连接子主要与美坦辛类载荷相关。二硫键的反应性可通过空间位阻调节：α-甲基取代显著影响还原速率和抗巯基二硫键交换。例如，sar-3419的连接子通过二甲基取代获得了spdb-DM4的最佳抗肿瘤活性。
腙连接子显示出pH依赖性稳定性，在中性pH下稳定，在酸性介质中水解（pH
该方法已成功应用于immu-110，它包含一个可裂解的酰基腙连接子，该连接子由4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯（MCC）的酰肼与阿霉素中存在的酮基反应形成。
腙连接子也常用于卡里霉素家族的载荷。在这种情况下，释放由两步激活过程触发：第一步是酸敏感腙水解，第二步是二硫键被GSH还原以使巯基中间体环化。该连接子已用于上市的Mylotarg和Besponsa，但它们在血浆中的稳定性不如预期，并且不如其他可裂解连接子有吸引力。
此外，引入了自降解间隔基以促进酶进入，从而限制载荷的空间位阻：在酸性介质中，对氨基苄氨基甲酸酯（PABA）自发进行1,6-消除，释放二氧化碳、对氮杂醌甲酰胺和阿霉素。最后，这一发现从前药领域转移到ADC领域，证明了Val-CIT和Phe-Lys二肽连接子的抗原驱动细胞活性。4
Val-Cit二肽是ADC中最常用的可裂解连接子。目前，临床阶段有多达25个分子，这可能是因为其总体良好的血浆稳定性、释放行为和化学可处理性。两种已获批的ADC药物（Adcetris和Polivy）使用相同的连接子MC-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺间隔基、作为组织蛋白酶底物的标准Val-CIT二肽序列和PABC自降解间隔基。
Val-Ala二肽也被广泛使用。有七个分子处于临床阶段。进展最快的是Loncastuximab tesirine，它包含一个PEG化间隔基以平衡属于PBD二聚体家族的载荷sg3199的亲脂性。 研究表明，Val-CIT由于沉淀和聚集难以实现高DAR。相比之下，Val-Ala连接子允许DAR高达7.4且聚集有限。 一些研究比较了Val-CIT和Val-Ala二肽与MMAE载荷连接的结构。在非内化抗体的情况下，与工程化半胱氨酸结合的Val-CIT和Val-Ala连接子显示出相似的特征，并且优于Val-Lys和Val-Arg类似物。在具有随机半胱氨酸结合的抗HER2 ADC的情况下，Val-Ala在高DAR结构中比Val-CIT显示出较少的聚集。另一方面，两种连接子在缓冲液稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征方面相似。 四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可裂解连接子的所有特征，用于已获批的ADC药物Enhertu。Enhertu的前期是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7。蛋白酶降解发生在溶酶体中，释放dx-8951f，它是一种源自依沙替康的有效拓扑异构酶I抑制剂。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR非常显著，因为这违背了高DAR偶联物可能具有较差药代动力学特征的广泛确立原则。这里使用的自降解间隔基是简单紧凑的半胺化，而不是Val-CIT连接子使用的PABC。
磷酸酶和焦磷酸酶
像组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶是选择性表达于溶酶体的水解酶。2016年，默克研究人员设计了一种含有磷酸盐和焦磷酸盐的连接子，与组织蛋白酶b敏感的Val-CIT-PABA配对以递送糖皮质激素：磷酸盐/焦磷酸盐部分结合在自降解间隔基PABA和载荷之间。内化后，载荷可以按顺序释放：组织蛋白酶B、自降解间隔基和磷酸酶（n=1）。对于焦磷酸盐（n=2），可能需要涉及焦磷酸酶的另一步骤。
这种亲水且永久带电的基团具有溶解性的优势。它不仅可以与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，还可以促进ADC的纯化。ADC中残留的连接子小于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外具有活性。β-葡萄糖醛酸酶β-葡萄糖醛酸酶是糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸残基的水解，在溶酶体和肿瘤基质中高表达。西雅图遗传学公司研究人员在2006年发表了一项开创性工作。抗CD70 ADC使用了含有葡萄糖醛酸的连接子，该连接子连接至自降解间隔基。该连接子表现出低水平的聚集、高血浆稳定性和强体内疗效。5
该连接子也应用于其他含胺载荷，如喜树碱类似物、sn38、杜卡霉素和苦参碱，通过额外的二甲基乙二胺（DMED）自降解间隔基。释放序列从β-葡萄糖醛酸的水解开始，到自降解间隔基，然后DMED自发发生另一环化反应，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，最终释放含羟基药物。由于连接子的亲水性，与组织蛋白酶敏感连接子相比，该技术使ADC制备DAR=8更容易。
β-半乳糖苷酶最近，一种利用β-半乳糖苷酶切割连接子的ADC方法被报道，该连接子含有PEG10间隔基。间隔基被硝基取代以提高自降解速率。类似于β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，这赋予化学前体亲水性。另一个优点是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体和实体瘤微环境中均有表达。研究表明，在释放MMAE的抗HER2 ADC中，含有β-半乳糖苷酶连接子的ADC在体外和体内比t-dm1更有效。
硫酸酯酶最近，出现了由硫酸酯酶切割的连接子，该酶在多种癌症类型中过表达，显示出潜在的选择性。研究涉及负载MMAE的抗HER2抗体。与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子在HER2上表现出类似的效力+细胞系。
参考文献：
1.Su Z , Xiao D , Xie F , et al. 抗体药物偶联物：连接子化学的最新进展[J]. 药学学报英文版, 2021.
2.Chen Y , Kim M T , Zheng L , et al. 曲妥珠单抗恩坦辛（Kadcyla）中交联物种的结构表征[J]. 生物共轭化学, 2016.
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4.Kostova V, Désos P, Starck JB, Kotschy A. ADC背后的化学. 制药学(巴塞尔). 2021;14(5):442.
5.Kostova, V.; Désos, P.; Starck, J.-B.; Kotschy, A. ADC背后的化学. 制药学 2021, 14, 442.
6.Singh A P , Sharma S , Shah D K . 抗体药物偶联物体外旁杀效应的定量表征[J]. 药代动力学与药效学杂志, 2016, 43(6):567-582.
7.Aleksandr V. Yurkovetskiy;Natalya D. Bodyak;Mao Yin;一种新型抗体药物偶联物平台，具有高载药量和可控旁观者效应
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