工程化抗体的位点特异性生物偶联与酶法
工程化抗体的位点特异性生物偶联
生物正交化学和蛋白质工程的进展有助于产生更均一的ADC。尽管在天然单克隆抗体上存在多种连接方法，但工程化抗体上的位点特异性生物偶联可以更有效地控制DAR并避免改变抗原结合亲和力。通过这种方式，在某些位置添加天然或非天然氨基酸，以获得具有优异药代动力学和药效学特性的均质产品。
酶法
通过将特定的氨基酸标签插入抗体序列，可以以非常选择性的方式实现有效载荷的连接。这些标签被特定的酶识别，如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物转谷氨酰胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而可以进行位点特异性偶联。
Aaron等人探索了一种新的醛标记蛋白位点特异性偶联方法。该技术利用基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达过程中共翻译氧化为甲酰甘氨酸。通过这种方式，工程化抗体通过氢化吡啶并螺环（hips）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。
微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也常被开发用于位点特异性偶联。MTGase催化糖基化抗体第295位谷氨酰胺侧链与底物伯胺之间肽键的形成。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有伯胺，就没有结构限制。
谷氨酰胺残基天然存在于McAb每个重链的Fc区域。在第295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，产生DAR=2的均一ADC。为了提高效率，可以偶联带有支链的连接子使DAR加倍，并且将第297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可以增加DAR。
NBE Therapeutics开发了基于金黄色葡萄球菌转肽酶A的介导偶联方法。他们的策略使用转肽酶A（srtA）切割lpxtg（X=任意氨基酸）五肽基序中苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键。然后催化甘氨酸标记的有效载荷与新形成的C端偶联，在生理温度和pH下形成肽键。
该方法应用于不同的抗体，如抗CD30和抗HER2，以及美坦新和MMAE与5-甘氨酸标记的连接子偶联。两种ADC均表现出与经典偶联相似的体外细胞毒性。通过酶法产生的曲妥珠单抗美坦新在体内测试中与Kadcyla完全匹配。在另一个例子中，通过转肽酶方法生成了高效蒽环类毒素衍生物pnu-159682的ADC。有趣的是，通过该技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，制备的pnu-159682 ADC在体内外具有高稳定性，并且显示出比含有微管靶向有效载荷的ADC更高的疗效。
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